顯微鏡的螢光系統-濾片基本規格判讀
螢光顯微鏡系統除了提供醫學單位重要的病理與臨床檢測判斷的工具外，在生物學相關的各領域中更是成為進階研究不可或缺強而有力的利器。
由於使用的螢光物質種類繁多，如何確認手邊的螢光濾片是否適合套用觀察目前的樣品也是要特別注意的地方。通常一組螢光濾片組會包含三片濾片：激發光過濾片(Excitation filter, EX)、二相反光片(Dichroic mirror, DM)以及散射光過濾片(Emission filter, EM，或稱Barrier filter, BA)。EX 數值表示入射光能通過EX濾片的波長範圍，而BA數值表示樣品被激發後的散射光能通過EM濾片的波長範圍。DM數值表示通過此濾片時會被反射的波長門檻(波長低於此門檻會反射，反之則會穿透)，且一般DM數值會介於EX 與 EM的波長之間，其中一個目的在於避免光源造成的cross talk干擾。今天在這裡跟大家分享如何看懂顯微鏡上螢光濾片的參數規格，找到更適合自己實驗的濾片組，收集DATA時更能得心應手。
確認規格時，建議先向試劑廠商取得螢光分子的EX與EM光譜資訊。以常見的DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole)分子為例，是常用於活細胞的細胞核染劑。DAPI分子的激發光譜和散射光譜峰值約為364 nm(EX)與454m(EM)。以NIKON所擁有的「DAPI」 及「UV-2A」 兩個濾片組為例，波長規格分別如表格所示，可以發現這兩組濾片組的EX波長範圍都有包含在DAPI分子的激發光譜中，而EM波長亦然。因此選擇這兩組濾片組均能應用在以DAPI標記細胞核(DNA)的實驗中，主要差異則在於散射光的濾片所收集的光譜範圍。透過光譜示意圖可發現「DAPI」濾片組可以較精確的收集特定範圍的藍色光波長(435~485 nm)以避免環境雜光或其他多重染色時所造成的cross talk干擾。相對的，「UV-2A」濾片可以將420nm之後的可見光譜訊號全數收集，雖然少了較純色的藍色訊號，但在某些訊號較弱的實驗中，較廣的收光範圍反而有利於訊號呈現。端看使用者對實驗DATA的需求而去選擇相對適合的濾片組。
對實驗室的螢光訊號有所疑問時，可以先檢查使用的濾片組資訊是否有與螢光目標的波長數值相對應，確認顯微鏡設定及是否套用正確的濾片組。其他因素如螢光燈泡壽命是否耗盡、螢光光路是否偏移需做校正、環境因素造成光路鏡片發霉等，也都可能對螢光訊號的觀察有所影響。如果儀器需要檢查保養、或實驗室需要安排顯微鏡螢光原理的教育訓練，歡迎與我們聯繫喔。
